CÁC KỸ THUẬT PCR VÀ ỨNG DỤNG

Thường quy và Hướng dẫn kỹ thuật-Xét nghiệm
Kỹ thuật PCR trong chẩn đoán lao
KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR)
PHÁT HIỆN M. TUBERCULOSIS TRỰC TIẾP TRONG MẪU BỆNH PHẨM



GIỚI THIỆU

I.. CÁC THÔNG TIN CHUNG CẤN BIẾT VỀ PCR

I.1. Nguyên lý của PCR

I.2. Thông số chu kỳ PCR

I.3. Các bước cần thiết để tránh nhiễm với M.tuberculosis hoặc sản phẩm PCR (amplicon) từ đợt trước

I.3.1. Yêu cầu đối với phòng thí nghiệm

I.3.2. Sử dụng enzyme tiêu diệt lây nhiễm sản phẩm PCR (amplicon) của những đợt trước

II. KỸ THUẬT PCR XÁC ĐỊNH M.TUB ERCULOSIS

II.1. Pha hỗn dịch Mix (thực hiện tại phòng chuẩn bị Mix)

II.2. Xử lý bệnh phẩm

II.3. Tách ADN của vi khuẩn lao trong bệnh phẩm (Phương pháp BOOM)

II.4. Cho mẫu vào ống phản ứng PCR

II.5. Chương trình chạy PCR

II.6. Điện di sản phẩm PCR

II.7. Chụp ảnh và đọc kết quả

III. CHUẨN BỊ HOÁ CHẤT, DUNG DỊCH CẦN THIẾT CHO PCR CHẨN ĐOÁN LAO


GIỚI THIỆU

Kỹ thuật PCR cho phép xác định tác nhân gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm nhờ khả năng nhận biết và sao chép để khuyếch đại về mặt số lượng đoạn trình tự đặc hiệu trên genom của vi khuẩn. Đối với M.tuberculosis, kỹ thuật PCR phát hiện trình tự 249 đôi bazơ nằm trên đoạn IS 6110, là trình tự gắn (IS-insert sequence) đặc hiệu và có khả năng tự sao chép với số lượng lớn (1-25 lần) trong genome vi khuẩn thuộc nhóm M.tuberculosis (M.tuberculosis, M.microti, M.bovis và M.africanum).

Quá trình sao chép được thực hiện trong một chu trình nhiệt lặp lại với sự tham gia của enzyme chịu nhiệu Taq polymerase có bản chất là ADN polymeraza, các deoxynucleotide triphosphat tự do (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) và cặp đoạn mồi đặc hiệu cho đoạn trình tự định sao chép.

Sản phẩm PCR được phát hiện bằng kỹ thuật điện di trên gen agarosa hoặc các kỹ thuật lai ghép miễn dịch khác như lai ghép Dot plot (dot blot hybridzation), lai ghép Southern blot hoặc lai ghép với cơ chất trên phiến nhựa, v.v.

I. CÁC THÔNG TIN CHUNG CẦN BIẾT VỀ PCR
I.1. Nguyên lý của PCR

PCR là kỹ thuật khuyếch đại số lượng ADN dựa trên trình tự ADN khuôn mẫu với quy trình tiến hành gồm 3 giai đoạn: biến tính, gắn mồi và tổng hợp kéo dài với sự trợ giúp của ADN polymerase chịu nhiệt, primers và deoxy-nucleotide triphosphates (dNTPs)
I.2. Thông số chu kỳ PCR

PCR được thực hiện với các chu trình ủ bệnh phẩm đã xử lý ở 3 nhiệt độ khác nhau tương ứng với 3 giai đoạn cần thiết cho việc tổng hợp ADN. Mỗi chu kỳ bao gồm 3 giai đoạn: Biến tính ở 90-950C, gắn mồi ở 40-650C và tổng hợp kéo dài ở 70-750C. Tuỳ theo nồng độ ADN đích có trong bệnh phẩm mà xác định số lượng chu kỳ cần thực hiện, số lượng trình tự khuyếch đại càng nhiều nếu số chu kỳ càng tăng.


I.3. Các bước cần thiết để tránh nhiễm với M.tuberculosis hoặc sản phẩm PCR (amplicon) từ đợt trước
I.3.1. Yêu cầu đối với phòng thí nghiệm:

Quy trình thực hiện PCR cần được tiến hành tại 3 phòng thí nghiệm khác nhau và theo nguyên tắc lưu thông một chiều để giảm thiểu lây nhiễm gây dương tính giả. Phòng thứ nhất: chuẩn bị hỗn dịch nền (Mix) chạy PCR; phòng thứ hai: chuẩn bị và xử lý mẫu bệnh phẩm và cho bệnh phẩm vào ống chứa mix; phòng thứ ba: phân tích sản phẩm PCR. Vận chuyển dụng cụ và hoá chất cần theo chiều từ phòng thứ nhất (chuẩn bị mix) đến phòng thứ ba, không được theo hướng ngược lại.

Các dung dịch hoá chất pha chế và xử lý cần được khử trùng bằng hấp ướt ở 1210C trong 20 phút. Nguyên vật liệu như ống chạy PCR, đầu côn, pipet Pasteur, ống đựng bệnh phẩm, găng tay, v.v. cần được vô trùng và chỉ được dùng 1 lần, không dùng lại.
I.3.2. Sử dụng enzyme tiêu diệt lây nhiễm sản phẩm PCR (amplicon) của những đợt trước:

Enzyme uracil ADN glycosylasa (UDG) có tác dụng nhận biết và cắt trình tự ADN-sản phẩm PCR ở vị trí Uracil (U) và tạo những mảnh ADN gãy vụn, vô hiệu hoá amplicon nhiễm từ những đợt PCR trước đó. Do vậy, trước khi thực hiện các chu kỳ khuyếch đại trong chu trình PCR, cần ủ bệnh phẩm ở 400C trong 10 phút